用于癌癥免疫療法的MR1限制性T細胞受體的制作方法

文檔序號:24728937發布日期:2021-04-16 23:27
用于癌癥免疫療法的MR1限制性T細胞受體的制作方法
用于癌癥免疫療法的mr1限制性t細胞受體
1.本發明涉及限于非多態性抗原呈遞分子mr1的腫瘤反應性人t細胞抗原受體(tcr)的鑒別。從代表新型的人t細胞群(由發明人發現并稱為mr1t的細胞)的克隆中分離功能性tcr轉錄序列,該人t細胞群在沒有添加任何外來抗原的情況下并以mr1依賴性的方式與表達mr1的腫瘤細胞反應。本發明還涉及mr1限制性腫瘤反應性tcr基因序列在癌癥治療中的使用。


背景技術:

2.t淋巴細胞可以檢測多種不同的由非多態性細胞表面分子呈遞的非肽抗原,包括脂質和磷酸化類異戊二烯。這些t細胞的多樣性表型和功能特性起到保護宿主免受感染、自身免疫和癌癥的特殊作用。針對非肽抗原的t細胞庫最近增加并包含粘膜相關的恒定t(mait)細胞,這些細胞對眾多酵母和細菌產生的小核黃素前體作出反應,并由mhc i類相關蛋白mr1呈遞。mait細胞在人血液、腎臟和腸道中很常見,并且包含大部分駐留在肝臟中的t細胞?;罨?,mait細胞釋放出一系列促炎和免疫調節細胞因子,并可介導直接殺傷被微生物感染的細胞。尚不清楚mr1除了將微生物代謝產物向mait細胞呈遞之外是否還有其他作用。
3.mr1為非多態性mhc i類蛋白,其在許多細胞類型的表面上以低水平表達。mr1在多個菌種中高度保守,人和小鼠mr1在蛋白質水平上具有>90%的序列同源性。
4.發明人提出了存在可識別由mr1呈遞的腫瘤相關抗原的人t細胞。這些新型t細胞可能參與腫瘤免疫監視,因此代表了癌癥免疫療法的新工具。用供體或源于患者的t細胞的過繼性療法(其設計成表達選定的腫瘤相關抗原的tcr)代表了在癌癥患者中誘導臨床相關的抗腫瘤免疫應答的一種有保證且安全的策略。然而,迄今為止已鑒別出的大多數腫瘤相關抗原是由多態性mhc分子呈遞的肽。mhc基因的極端多態性限制了該方法在表達獨特mhc等位基因的患者中的應用。靶向與非多態性抗原呈遞分子(諸如mr1)結合的腫瘤抗原可以克服該限制,并且原則上適用于患有表達mr1的腫瘤的所有患者。使用識別mr1呈遞的抗原的腫瘤反應性t細胞受體也可能具有補充由mhc呈遞的肽抗原介導的抗腫瘤反應的優點,這排除了腫瘤抗原與相同類型的呈遞分子結合所產生的交叉競爭。此外,該策略可提供在相同腫瘤細胞上靶向不同性質的抗原的可能性,從而最大限度地減少在選定性免疫壓力下腫瘤逃逸變體的潛在發生。因此,鑒別mr1呈遞的腫瘤相關抗原以及識別這些抗原的mr1限制性tcr的表征可能對癌癥免疫療法具有重要意義。
5.基于本領域的上述狀態,本發明的目的是提供治療癌癥的新型手段和方法。該目的通過獨立權利要求的主題實現,并且通過本文公開的從屬權利要求、示例和附圖提供了進一步有利的解決方案。
6.定義
7.在本說明書的上下文中,術語mr1是指mr1基因(entrez 3140)或mr1基因產物(uniprot q95460)。
8.mr1在非腫瘤患者的生理環境中呈遞細菌核黃素副產物(以上稱為“外源微生物衍
生抗原”)并將其呈遞給粘膜不變性t細胞。
9.表達mr1的癌細胞在mr1上呈現特定的癌癥抗原或許多特定的癌癥抗原。
10.在本說明書的上下文中,術語mr1t細胞是指表達能夠與癌細胞呈遞的mr1分子特異性結合的t細胞受體的t細胞。
11.在本說明書的上下文中,術語mr1t細胞受體是指能夠特異性結合由與mr1分子相關的癌細胞呈遞的抗原的t細胞受體。
12.本文所述的tcr序列或tcr分子包含完全有功能的tcrα和tcrβ多肽鏈,或tcrγ和tcrδ多肽鏈。如果提及具有特定序列的tcrα或β多肽,應理解為使其在本文所述的方法和細胞中完全有功能,需要存在互補的(分別為β或α)多肽鏈。同樣,必要的修改也適用于γδ對。提及特定的tcrα、β、γ或δ序列意味著,它有可能與本文所述的原始克隆中與之配對的tcr序列配對,或與原始配對序列具有某些同一性的序列,如本文指定。提及特定的tcrα、β、γ或δ序列也意味著它可能與另一對配對的tcr序列配對。
13.mr1呈遞的癌癥抗原的識別主要通過cdr3序列進行。其中本文提及僅以特定cdr3序列為特征的tcr序列,暗示該tcr序列是本文提供的完整α、β、γ或δtcr序列,并且所得的tcr分子與適當的第二序列配對。
14.在本說明書的上下文中,術語序列同一性和序列同一性百分比是指單個定量參數,其表示通過逐個位置比較兩個比對的序列而確定的序列比較結果。用于比較的序列比對方法是本領域公知的。用于比較的序列的比對可以如以下進行:smith and waterman,adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源算法,needleman and wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的全局比對算法,pearson and lipman,proc.nat.acad.sci.85:2444(1988)的尋找相似性方法,或通過這些算法的計算機化實施,包括但不限于:clustal、gap、bestfit、blast、fasta和tfasta。用于進行blast分析的軟件是可公開獲得的,例如通過國家生物技術信息中心(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。
15.比較氨基酸序列的一個實例是使用默認設置的blastp算法:期望閾值:10;字長:3;查詢范圍內的最大匹配項:0;矩陣:blosum62;空位罰分:存在11,擴展1;組成調整:條件組成評分矩陣調整。用于比較核酸序列的一個此類實例是使用默認設置的blastn算法:期望閾值:10;字長:28;查詢范圍內的最大匹配項:0;匹配/不匹配評分:1.
?
2;空位罰分:線性。除非另有說明,否則本文提供的序列同一性值是指使用blast程序套件altschul et al.,j.mol.biol.215:403
?
410(1990))使用上面確定的蛋白質和核酸比較默認參數獲得的值。
16.引用同一序列但未指定百分比值表示100%同一序列(即相同序列)。
17.在本說明書中,術語陽性當在上下文中用于標記物表達時,是指通過熒光標記的抗體測定的抗原的表達,其中該熒光的中值熒光強度與用同型匹配的抗體染色后得到的熒光強度相比,至少高30%(≥30%),特別是≥50%或≥80%,所述同型匹配的抗體不與相同的靶細胞特異性結合。這樣的標記物表達由該標記物的名稱后面的上標“加號”(+)表示,例如cd4
+
。
18.在本說明書中,當在上下文中用于標記物表達時,術語陰性是指由熒光標記的抗體測定的抗原的表達,其中該熒光的中值熒光強度不高于用同型匹配的抗體染色后得到的熒光強度的130%,特別是不高于115%,所述同型匹配的抗體不與相同的靶細胞特異性結
合。這樣的標記物表達由標記物名稱后面的上標減號(
?
)表示,例如cd127
?
。
19.在本說明書的上下文中,術語核酸表達載體涉及質?;虿《净蚪M,其用于以一定的方式轉染(在質粒的情況下)或轉導(在病毒基因組的情況下)帶有某種目的基因的靶細胞。目的基因受啟動子序列的控制,并且該啟動子序列可在靶細胞內部操作,因此,目的基因可組成性或響應刺激轉錄,或取決于細胞的狀態。在某些實施方案中,將病毒基因組包裝到衣殼中以成為能夠轉導靶細胞的病毒載體。


技術實現要素:

20.在最廣泛的意義上,本發明涉及治療癌癥的方法,其中從與表達mr1的癌細胞具有反應性的t細胞(mr1t細胞)中分離的tcr序列在基因轉移入患者的t細胞群中后表達。這些外源性、轉基因表達的tcr序列用于將對表達mr1的癌細胞特異性識別能力賦予t細胞,作為對患者腫瘤的治療。
21.本發明類似地提供了t細胞和t細胞制劑,所述t細胞制劑包含用mr1t細胞特異性tcr基因轉導的多個t細胞。在某些實施方案中,用mr1t細胞tcr基因轉導的t細胞可以與其他治療干預組合用于過繼性細胞免疫療法。
22.本發明還涉及根據我們先前建立的方案(de libero,同上)從相同的癌組織活檢中制備腫瘤浸潤性t細胞的方法。針對表達mr1蛋白的腫瘤細胞系測試各個t細胞克隆。研究了反應性最強的t細胞克隆的mr1限制性、腫瘤殺傷力和炎性細胞因子的釋放。對所選t細胞克隆的tcr基因進行測序。
具體實施方式
23.反應性細胞對與表達mr1的癌細胞(以mr1限制性方式呈遞癌抗原)的接觸產生響應時,其會上調活化標記物(特別是前述段落中記載的標記物),釋放細胞因子并開始增殖。
24.換句話說,顯示mr1限制性活性的t細胞是可以由mr1顯示的腫瘤相關的抗原激活的t細胞。
25.這些細胞可以在對標記物具有特異性的經適當熒光標記的抗體染色后通過熒光激活細胞分選(facs)進行分選,或者通過用適當抗體標記的磁珠進行分選(這是臨床環境中常用的分選方法)。
26.本發明的第一方面涉及一種在不存在外源抗原時產生與mr1反應的轉基因mr1t細胞制劑的方法。該方法首先涵蓋確定哪些t細胞受體最可能對患者中特定的表達mr1的癌癥具有反應性,然后從轉移到細胞中的表達構建體制備表達這些特異性t細胞受體基因的t細胞群,以及將這些設計好的t細胞給患者施用。
27.該方法包括以下步驟:
28.a.提供從患者獲得的腫瘤樣品;
29.b.將所述腫瘤樣品與多個對mr1反應的mr1t細胞受體分子接觸,并且
30.?
在多個t細胞克隆上呈遞,其中每個t細胞克隆的特征在于具有與mr1反應的mr1t細胞受體分子;或
31.?
作為經過標記的可溶性mr1t細胞受體分子,以非細胞依賴性方式進行識別;
32.c.識別對所述腫瘤樣品特異性反應的多個t細胞克??;
33.d.提供t細胞制劑,特別是從同一患者獲得的t細胞制劑;
34.e.將一核酸表達構建體引入所述t細胞制劑從而產生轉基因t細胞制劑,所述核酸構建體編碼在所述t細胞克隆上表達的mr1反應性t細胞受體分子,其在步驟c中被識別出與所述腫瘤樣品特異性反應。
35.因此可以將患者的轉基因t細胞制劑施用給患者。
36.在某些實施方案中,每個mr1特異性t細胞克隆或分離的、被標記的和多聚化的可溶性t細胞受體的特征在于選自seq id no 065至seq id no 096中任一項的cdr3序列片段。同樣,cdr3序列片段的特征在于與選自seq id no 065至seq id no 096中任一項的序列同一但具有一個或兩個氨基酸取代的序列。在特定的實施方案中,據以下取代規則選擇cdr3序列取代:
37.?
甘氨酸(g)和丙氨酸(a)可互換;纈氨酸(v)、亮氨酸(l)和異亮氨酸(i)可互換,a和v可互換;
38.?
色氨酸(w)和苯丙氨酸(f)可互換,酪氨酸(y)和f可互換;
39.?
絲氨酸(s)和蘇氨酸(t)可互換;
40.?
天冬氨酸(d)和谷氨酸(e)可互換
41.?
天冬酰胺(n)和谷氨酰胺(q)可互換;n和s可互換;n和d可互換;e和q可互換;
42.?
蛋氨酸(m)和q可互換;
43.?
半胱氨酸(c)、a和s可互換;
44.?
脯氨酸(p)、g和a可互換;
45.?
精氨酸(r)和賴氨酸(k)可互換。
46.在某些實施方案中,每個mr1特異性t細胞克隆或分離的、被標記的和多聚化的可溶性t細胞受體的特征在于選自seq id no 065至seq id no 096中任一項的cdr3序列,其中根據上述在三個n和/或c末端位置中的取代規則,該序列在三個n和/或c末端位置中包含總共最大0、1、或2個取代,而所示的cdr3序列的中心氨基酸沒有改變。已知cdr3序列的中心部分對抗原結合或識別特異性貢獻最大。
47.在某些實施方案中,每個mr1特異性t細胞克隆或分離的、被標記的和多聚化的可溶性t細胞受體的特征在于選自seq id no 007至seq id no 012或seq id no 037至seq id no 060或seq id no 063至seq id no 064的核酸序列和/或選自seq id no 001至seq id 006或seq id no 013至seq id no 036或seq id no 061至seq id no 062的氨基酸序列。
48.在某些實施方案中,每個mr1特異性t細胞克隆或分離的、被標記的和多聚化的可溶性t細胞受體的特征在于
49.在本文中,“相同的生物學活性”是指重組tcr序列識別在癌細胞上呈遞癌癥抗原的mr1分子(或有助于識別)的能力。本文描述了確定這種相互作用的測定和方法。
50.在某些實施方案中,每個mr1特異性t細胞克隆或分離的、被標記的和多聚化的可溶性t細胞受體的特征在于選自seq id no 007、009至011或seq id no 037至seq id no 048的t細胞受體α鏈核酸序列和/或選自seq id no 001、003至005或seq id no 013至seq id no 024的氨基酸序列。
51.在某些實施方案中,每個mr1特異性t細胞克隆或分離的、被標記的和多聚化的可
015和seq id no 027;或seq id no 016和seq id no 028;或seq id no 017和seq id no 029;或seq id no 018和seq id no 030;或seq id no 019和seq id no 031;或seq id no 20和seq id no 032;或seq id no 021和seq id no 033;或seq id no 022和seq id no 034;或seq id no 023和seq id no 035;或seq id no 024和seq id no 036;或從前兩段給出的對中選擇的一對其中每個配偶體可以與指示的seq id no具有至少85%(≥90%、95%、98%)同一性的序列并且該對具有與未突變對相同的生物學活性。
59.在某些實施方案中,每個mr1特異性t細胞克隆或分離的、被標記的和多聚化的可溶性t細胞受體的特征在于t細胞受體γ鏈和δ鏈氨基酸序列選自seq id no 061和seq id no 062。
60.在某些實施方案中,根據本發明的t細胞制劑從同一患者獲得(自體過繼性t細胞療法)。該方法具有避免不良反應風險的優點,特別是由設計的t細胞制劑的內源性t細胞受體驅動的同種免疫反應。
61.在某些實施方案中,根據本發明的t細胞制劑從另一個受試者獲得,特別是與hla匹配的受試者(同種異體過繼性t細胞療法)。取決于hla匹配的質量,同種免疫的風險可能會很大,但與定制的患者個體療法高得多的成本和監管障礙相比,大量選定預先制備的tc制劑的后勤和程序優勢可能有助于該療法在更大的患者群體中進行。
62.將mr1t細胞受體表達構建體引入t細胞制劑中可以通過慢病毒轉導實現,發明人在mr1t細胞的工作中經常使用慢病毒轉導,或通過dna表達載體(質粒)或rna轉染的標準方法實現。本領域技術人員知曉相關的方案和程序。
63.任選地,轉基因t細胞制劑可以在施用于患者之前保持培養一段時間以擴增其數量,并且再次任選地,進一步刺激其分化成特別期望的t細胞亞組。
64.在某些實施方案中,從所述患者獲得的t細胞制劑獲自患者的外周血,特別是其中所述t細胞制劑通過選定外周血單核細胞(pbmc)以表達cd4、cd8、cd27、cd45ra和cd57中的一種或多種t細胞標記物而獲得的。
65.在某些實施方案中,從所述患者獲得的t細胞制劑是從腫瘤活檢中獲得的,隨后相繼在體外擴增。在某些實施方案中,在植物凝集素、il
?
2、il
?
7和il
?
15的存在下,t細胞擴增。增殖t細胞通過磁分選分離并用于t細胞受體設計或用于克隆和分離腫瘤特異性mr1限制性t細胞。分離的mr1t細胞用于tcr基因克隆。
66.多個mr1特異性t細胞克隆可以在上述程序之前制備,并且以庫或組的形式保存,以便在需要快速表征出現腫瘤時進行臨時使用。該步驟基本上是鑒別可識別特定腫瘤實體的mr1特異性t細胞受體分子。
67.或者,可以產生可溶性mr1t tcr并使其多聚化(參見subbramanian et al.nature biotechnology,22,1429,(2004))。tcr多聚體將用熒光染料標記并用于染色從腫瘤活檢分離的腫瘤細胞??扇苄詍r1t tcr多聚體的結合將指示mr1t tcr識別腫瘤細胞的能力,因此將有助于選定適合該患者的基因療法的mr1t tcr。
68.本發明的另一方面涉及表達載體,其包含編碼功能性t細胞受體異二聚體的核酸序列并使其轉錄,或能夠與t細胞受體β鏈一起形成功能性t細胞受體異二聚體的t細胞受體α鏈,和/或能夠與t細胞受體α鏈一起形成功能性t細胞受體異二聚體的t細胞受體β鏈。值得注意的是,發明人也發現了mr1特異性γ
?
δ異二聚體,因此上述限定同樣適用于這些鏈。
69.在表達載體包含編碼t細胞受體α鏈或t細胞受體β鏈(或γ或δ鏈)的核酸序列的實施方案中,必須將兩種不同的表達載體(一種編碼α鏈(γ鏈)和一種編碼β鏈(δ鏈))引入細胞中,以使所述細胞能夠表達功能性t細胞受體異二聚體。t細胞受體異二聚體特異性結合mr1分子,其中所述mr1分子在腫瘤細胞上表達并呈遞腫瘤相關抗原。
70.上述核酸序列的表達由可在哺乳動物細胞,特別是人t細胞中運作的啟動子序列控制。在某些實施方案中,啟動子是組成型活化的啟動子,例如通常用于分子生物學的cmv即刻早期啟動子。在某些其他實施方案中,所述啟動子是誘導型啟動子。
71.在本發明該方面的某些實施方案中,表達載體中包含的核酸序列是或包含選自seq id no 007、seq id no 009或seq id no 011的核酸序列,和/或編碼選自seq id no 001、seq id no 003或seq id no 005(α鏈)的氨基酸序列。
72.在本發明該方面的某些實施方案中,表達載體中包含的核酸序列是或包含選自seq id no 008、seq id no 010或seq id no 012的核酸序列,和/或編碼選自seq id no 002、seq id no 004或seq id no 006(β鏈)的氨基酸序列。
73.本發明的另一方面涉及一種編碼功能性t細胞受體異二聚體的核酸序列。t細胞受體異二聚體特異性地結合在呈遞腫瘤相關抗原的腫瘤細胞上表達的非多態性mhc i相關(mr1)的抗原呈遞分子。
74.在某些實施方案中,核酸序列編碼t細胞受體α鏈并且選自seq id no 007、seq id no 009或seq id no 011,或編碼與選自seq id no 001、seq id no 003或seq id no 005的氨基酸序列對應的t細胞受體α鏈。
75.在某些實施方案中,核酸序列編碼t細胞受體β鏈并且選自seq id no 008、seq id no 010或seq id no 012或編碼由選自seq id no 002、seq id no 004或seq id no 006的氨基酸序列指定的t細胞受體β鏈,或與選自seq id no 001至006的氨基酸序列至少具有85%(≥90%、95%、98%)同一性且具有相同生物學活性的序列。在特定實施方案中,每個氨基酸序列包含選自seq id 65、66、67、80、81和82的cdr3序列。
76.在某些實施方案中,mr1 t細胞受體由本文公開的一條α鏈和一條β鏈構成。發明人出人意料地發現α和β鏈可以組合以產生能夠識別mr1的功能性tcr分子。
77.在某些實施方案中,mr1t細胞受體由一個α鏈和一個β鏈構成,與以下列表的序列所對應:
78.a.seq id no 001和002,
79.b.seq id no 003和004,
80.c.seq id no 005和006,
81.或選自以上給出的對的一對,其中每個配偶體可以與所指示的seq id no具有至少85%(≥90%、95%、98%)同一性的序列并且該對與未突變的對具有相同的生物學活性。在特定實施方案中,每個氨基酸序列均包含與指示的seq id no相同的cdr3序列,如可從下表推斷出。
82.本發明的另一方面涉及一種與非多態性mhc i相關的mr1抗原呈遞分子結合的t細胞受體蛋白。mr1分子在腫瘤細胞上表達并呈遞腫瘤相關抗原。在某些實施方案中,通過根據本發明第一方面的方法鑒別結合非多態性mhc i相關mr1抗原呈遞分子的t細胞受體蛋白。
83.在某些實施方案中,t細胞受體蛋白包含t細胞受體α鏈,其特征在于選自seq id no 001、seq id no 003或seq id no 005的氨基酸序列,以及t細胞受體β鏈,其特征在于選自seq id no 002、seq id no 004或seq id no 006的氨基酸序列。
84.本發明的另一方面涉及一種重組細胞,其包含如前述段落所述的根據本發明的表達載體和/或根據本發明的t細胞受體多肽。本領域技術人員知道,在表達載體僅包含編碼t細胞受體α鏈或t細胞受體β鏈的核酸序列,而不是兩者都包含的情況下,必須將兩種不同的表達載體(一種編碼α鏈,以及一種編碼β鏈)引入重組細胞中,以便使所述細胞能夠表達功能性t細胞受體異二聚體。在某些實施方案中,重組細胞源于外周血的t細胞。在某些實施方案中,重組細胞源于腫瘤浸潤淋巴細胞。
85.本發明的另一個方面涉及根據本發明前述方面的重組細胞在癌癥冶療或預防方法中的使用。該方法包括施用重組細胞。
86.在某些實施方案中,所述癌癥的特征在于表達mr1。
87.在某些實施方案中,通過過繼性t細胞免疫療法實現該施用。
88.本發明進一步涉及一種治療或預防癌癥復發的方法,包括施用根據本發明的重組細胞。在某些實施方案中,所述癌癥的特征在于表達mr1。
89.在某些實施方案中,通過過繼性t細胞免疫療法實現該施用。
90.本發明還涉及核酸序列的集合,其中該集合的每個序列編碼不同的t細胞受體α鏈、t細胞受體β鏈、t細胞受體γ鏈、t細胞受體δ鏈或t細胞受體α鏈和β鏈的組合,或t細胞受體γ鏈和δ鏈的組合,其中所述組合能夠特異性結合呈遞癌癥抗原的mr1分子。核酸序列能夠促進哺乳動物細胞中t細胞受體α鏈、β鏈或α和β鏈組合的表達。
91.該集合將用于選定轉基因構建體,以轉移到從患者收集的t細胞中。在鑒別出最適合在該治療方法的第一階段對腫瘤所呈遞的一組特定腫瘤抗原發起反應的tcr序列后,醫生將需要能夠從根據gmp制造的該集合中選定預先產生的表達載體,以快速實現基因轉移到患者的t細胞中。
92.在某些實施方案中,該集合包含選自seq id no 007至seq id no 012的序列,和/或該集合包含編碼選自seq id no 001至seq id no 006的t細胞受體分子(或構成α或β的t細胞受體)的序列。
93.本發明的另一個方面涉及一種重組t細胞集合,其中該集合的每個細胞表達能夠與呈遞癌抗原的mr1分子特異性結合的t細胞受體作為轉基因體。在某些實施方案中,該集合包含這樣一種重組t細胞,該重組t細胞包含根據本發明各方面的t細胞受體蛋白異二聚體。
94.發明人鑒別并分離了一種新型人mr1限制性t細胞群體,該群體以mr1依賴性方式對多種腫瘤細胞產生反應。mr1t細胞克隆通常在不同健康個體的血液中發現,表達不同的tcr基因,并且不識別先前鑒別的mr1微生物或葉酸衍生配體。相反,他們認識到從腫瘤細胞中分離并由mr1呈遞的各種不同組的未知抗原。目前正在進行與腫瘤細胞相關的刺激性抗原的鑒別和表征。mr1t細胞克隆識別并殺傷不同類型的腫瘤細胞,因此在體外顯示出標記的抗腫瘤活性。此外,他們釋放th1、th2和th17細胞因子的不同組合,并顯示多種趨化因子受體表達譜、表明表型和功能多樣性。重要的是,當從各個的mr1t細胞克隆分離的配對的tcrα和β基因或tcrγ和δ基因轉移到tcr缺陷的t細胞中時,受體t細胞獲得識別表達mr1的
腫瘤細胞的能力,從而表明mr1t細胞tcr基因轉移對于該類型的腫瘤識別是足夠的,并且可以用于指示選定的t細胞識別表達mr1的腫瘤細胞。
95.總之,這些發現揭示了一種新型功能多樣的腫瘤反應性人t細胞群,其限于非多態性mr1分子,在腫瘤免疫中具有不同的潛在作用,從而為癌癥免疫監測和免疫療法提供新的概念框架。
96.在本說明書中,使用以下縮寫:apc:抗原呈遞細胞;β2m:β2微球蛋白;dc:樹突狀細胞;gm
?
csf:粒細胞
?
巨噬細胞菌落刺激因子;hplc:高壓液相色譜法;ifn
?
γ:干擾素
?
γ;mab:單克隆抗體;mait細胞:粘膜相關的不變t細胞;mhc:主要組織相容性復合體;mr1:mhc i類相關分子;mr1t細胞:mr1限制性t細胞;pbmc:外周血單核細胞;tcr:t細胞受體;til:腫瘤浸潤淋巴細胞。
97.通過以下示例和附圖進一步說明本發明,從中可以得出進一步的實施方案和優點。這些示例旨在說明本發明,但不限制其范圍。
附圖說明
98.圖1.mr1t細胞不識別微生物抗原。(a)ccrfsb、thp
?
1和a375
?
mr1細胞對mr1的表面表達?;疑狈綀D表示用同型匹配的對照mab染色。在不存在(無ag)或存在大腸桿菌裂解物(大腸桿菌)和/或抗mr1阻斷mab(α
?
mr1)的情況下,由三種細胞系在a中刺激(b)mr1t細胞克隆dgb129或(c)mait細胞克隆smc3。mait克隆smc3先前從健康供體的pbmc中分離并表達經典的mait表型和功能。柱表示ifn
?
γ釋放(平均值
±
sd)。thp
?
1細胞刺激(d)dgb129 mr1t或(e)smc3 mait細胞,結構上表達表面mr1,載有合成的6,7
?
二甲基
?8?
d
?
核糖基嗪(rl
?
6,7
?
二聚體)以及具有或不具有抗mr1 mab。柱表示平均ifn
?
γ釋放+sd。數據代表四個(a、b和c),兩個(d和e)。*p<0.05(非配對student t檢驗)。
99.圖2.從外周t細胞中分離mr1t細胞克隆的策略。(a)在不存在外源抗原的情況下與a375
?
mr1細胞過夜共培養后,用經照射的a375
?
mr1細胞預先擴增的純化t細胞的facs分析。左點圖顯示活細胞中的cd3和細胞追蹤紫色(ctv)染色。右點圖顯示cd3陽性ctv陰性門控細胞的cd69和cd137表達。箭頭表示門控層次結構。數字表示門內細胞的百分比。來自供體a的細胞示出為代表性供體。(b,d)從供體a和b篩選的t細胞克隆的累積結果。如a中所示,從cd3
+
ctv
?
cd137
+
分選的t細胞產生t細胞克隆。圖表顯示各個克隆(x軸)及其ifn
?
γ釋放(y軸),表示為響應于a375
?
mr1細胞對a375 wt細胞分泌的細胞因子的量之間的比率。每個點代表單個t細胞克隆,在指定的實驗條件下同時測試。垂直線表示顯示mr1限制性反應性的t細胞克隆的數量(即顯示ifn
?
γ釋放率高于任意截止值2的克隆)。結果代表兩個獨立實驗。(c,e)在阻斷抗mr1 mab(α
?
mr1)存在下用a375 wt、a375
?
mr1和a375
?
mr1刺激后,供體a和來自供體b的11個克隆的14個代表性克隆釋放ifn
?
γ。點代表每個克隆的ifn
?
γ釋放(重復培養物的平均值
±
sd)。結果代表三個獨立實驗。*p<0.05(非配對student t檢驗)。
100.圖3.mr1t細胞在健康個體的血液中是常見的。(a)在與a375 wt或a375
?
mr1細胞過夜共培養后,來自代表性供體(供體c)的純化t細胞的流式血細胞術分析。點圖顯示活cd3
+
細胞上的cd69和cd137表達。數字表示門中細胞的百分比。(b)與a375 wt或a375
?
mr1細胞過夜共培養后來自5個不同供體的cd69
+
cd137
+
t細胞的頻率。(c)來自供體c的t細胞克隆刺激測定的累積結果。從cd3
+
cd69
+
cd137
+
分選的t細胞產生t細胞克隆,如右點圖所示。該圖顯示
了測試克隆的數量(x軸)和ifn
?
γ釋放(y軸),表示為響應于a375
?
mr1細胞對a375 wt細胞分泌的細胞因子的量之間的比率。每個點代表單個t細胞克隆,在指定的實驗條件下同時測試。垂直線表示顯示mr1限制性反應性的t細胞克隆的數量(即顯示ifn
?
γ釋放率高于任意截止值2的克隆)。結果代表兩個獨立實驗。(d)來自供體c的8個代表性mr1限制性t細胞克隆在沒有外源抗原的情況下識別a375
?
mr1但不識別a375 wt細胞。通過阻斷抗mr1 mab(α
?
mr1)抑制t細胞克隆對a375
?
mr1細胞的反應性。點代表在三個實驗條件下測試的每個克隆的ifn
?
γ釋放(重復培養物的平均值
±
sd)。結果代表三個獨立實驗。*p<0.05(非配對student t檢驗)。
101.圖4.mr1t tcr基因轉移賦予a375細胞mr1限制性識別。分別在大腸桿菌裂解物和抗mr1 mab存在或不存在的情況下,通過表達(a375
?
mr1)或缺少(a375 wt)mr1的a375細胞刺激(a)表達dgb129 tcr(skw3
?
dgb129)的skw
?
3細胞和(b)表達mait mrc25 tcr(j.rt3
?
mait)的j.rt3
?
t3.5細胞。在存在或不存在抗mr1 mab的情況下,用a375
?
mr1或a375 wt細胞通過三種單獨mr1t細胞克隆(c)dga4(skw3
?
dga4)、(d)dgb70(skw3
?
dgb70)和(e)jma(skw3
?
jma)刺激表達tcr的skw
?
3細胞。示出了轉導的t細胞的重復培養物的cd69中值熒光強度(mfi)+sd。還示出了在不存在apc的情況下培養的轉導t細胞的cd69 mfi。當與a375
?
mr1或a375 wt孵育時,模擬轉導的t細胞示出了cd69表達的背景水平(未示出)。數據代表三次獨立的實驗。*p<0.05(非配對student t檢驗)。
102.圖5.mr1t細胞克隆對各種類型腫瘤細胞的鑒別識別。(a)在沒有(無ag)或存在大腸桿菌裂解物(大腸桿菌)的情況下,通過代表性smc3 mait細胞克隆識別表達mr1組成型表面水平的四種人細胞系,該裂解物具有或不具有抗mr1阻斷mab(α
?
mr1)。(b)通過具有或不具有抗mr1 mab(α
?
mr1)的13個mr1t細胞克隆識別與a中相同的細胞類型。圖表顯示ifn
?
γ釋放(重復培養物的平均值
±
sd)。
103.圖6.mr1t細胞克隆不與微生物配體或6
?
fp反應。(a)在存在或不存在大腸桿菌裂解物的情況下,7個mr1t細胞克隆和一個對照mait細胞克隆與表達(a375
?
mr1)或不表達a375細胞(a375 wt)mr1共培養的反應。還示出了由抗
?
mr1 mab(α
?
mr1)阻斷t細胞克隆反應性。(b)在6
?
甲酰蝶呤(6
?
fp)存在下,mr1t細胞克隆對表達wt mr1分子(a375
?
mr1)或k43a突變的mr1分子(a375
?
mr1 k43a)的a375細胞的響應。(c)用a375
?
mr1或a375
?
mr1 k43a細胞刺激對照mait細胞克隆mrc25或對照tcr vγ9vδ2克隆g2b9,該細胞預先分別在沒有或存在6
?
fp的情況下與大腸桿菌裂解物或唑來膦酸鹽一起孵育。結果表示為在重復培養物中測量的ifn
?
γ的平均值
±
sd。結果代表三個獨立實驗。*p<0.05(非配對student t檢驗)。
104.圖7.mr1t細胞克隆不識別ac
?6?
fp。(a)在不存在或存在乙?;?br/>?6?
甲?;?ac
?6?
fp)的情況下通過a375
?
mr1細胞刺激三個代表性mr1t細胞克隆。(b)在不存在或存在ac
?6?
fp的情況下,用大腸桿菌裂解物脈沖的a375
?
mr1細胞刺激兩個mait細胞克隆(mrc25和smc3)。(c)在不存在或存在ac
?6?
fp(25μg/ml)的情況下,用唑來膦酸鹽(zol)處理a375
?
mr1細胞,并用于刺激tcrvγ9
?
vδ2細胞克隆(g2b9)。(d)在不存在或存在ac
?6?
fp(25μg/ml)的情況下,使用表達k43a突變體mr1分子(a375
?
mr1k43a)的a375細胞刺激a中示出的三個mr1t細胞克隆。(e)在不存在或存在ac
?6?
fp(25μg/ml)的情況下,用大腸桿菌裂解物脈沖的a375
?
mr1 k43a細胞刺激b中使用的兩個mait細胞克隆。結果表示為在重復培養物中評估的ifn
?
γ釋放的平均值
±
sd,并且代表三個獨立實驗。*p<0.05(非配對student t檢驗)。
105.圖8.mr1t細胞識別腫瘤細胞中存在的抗原,而不是源自rpmi 1640培養基。通過mr1過表達(a)a375細胞(a375
?
mr1)和(b)thp
?
1細胞(thp1
?
mr1)在rpmi 1640或pbs中生長4天刺激dgb129 mr1t細胞克隆,兩者都補充有5%的人血清。示出了抗mr1阻斷mab(α
?
mr1)對t細胞克隆反應性的抑制。dgb129細胞識別載有分離自(c)thp
?
1細胞裂解物或來自(d)體內生長的小鼠乳腺腫瘤emt6的apc分離物。分離物e1和e2含有疏水分子;分離物n1至n4含有親水分子。(e)dgb70 mr1t細胞與thp
?
1裂解物的n3分離物反應。(f)通過加載到塑料結合的重組mr1上的thp
?
1衍生的分離物n3和n4刺激dgb129和dgb70t細胞。示出了重復培養物的ifn
?
γ或gm
?
csf平均值
±
sd的t細胞釋放(代表三次獨立實驗)??偧毎蜃俞尫旁诮Ma、組b、組f中示出;在組c、組d、組e中示出了背景上的折疊增加。*p<0.05(非配對student t檢驗)。
106.圖9.mr1t細胞顯示出不同的抗腫瘤反應。表達mr1的腫瘤細胞系thp
?
1和a375與mr1t細胞克隆(a)dgb129或(b)dgb70以指定的效應物:靶向(e:t)比率培養過夜。該圖示出了在各個實驗條件下凋亡靶細胞的百分比,通過使用膜聯蛋白v和碘化丙錠染色的流式細胞術評估。通過用抗cd3 mab染色鑒別mr1t細胞并從分析中排除??筸r1(α
?
mr1)mab對mr1t細胞克隆殺傷能力的抑制也以1:1e:t比例示出。(c)通過具有或不具有抗mr1mab(α
?
mr1)的13個mr1t細胞克隆從健康個體分離的mo
?
dc的識別。圖表顯示ifn
?
γ釋放(重復培養物的平均值
±
sd)。(d)在不存在或存在抗mr1(α
?
mr1)mab的情況下,由代表性dgb129 mr1t細胞克隆識別來自三個供體的mo
?
dc。示出上清液中的ifn
?
γ釋放并表示為平均值
±
sd。(e)與具有或不具有抗mr1 mab(α
?
mr1)的dgb129 mr1t細胞共培養后,mo
?
dc上的共刺激分子cd83和cd86的流式細胞術分析。還示出了在不存在t細胞的情況下用lps(10ng/ml)刺激的mo
?
dc組成的對照組。數字表示每個象限中細胞的百分比。(f)在存在或不存在抗mr1 mab(α
?
mr1)的情況下通過ls 174t和hct116胃腸道腫瘤細胞系和正常腸上皮細胞(gec)刺激jman mr1t細胞克隆。柱顯示ifn
?
γ釋放(重復培養物的平均值
±
sd)。所有結果均代表至少三次獨立實驗。*p<0.05(未配對學生的t
?
檢驗)。
107.圖10.mr1t細胞克隆的功能多樣性。(a)由用a375
?
mr1細胞刺激的7個選定的mr1t細胞克隆釋放的ifn
?
γ。elisa結果表示為在重復培養物中測量的ifn
?
γ釋放的平均值
±
sd。(b)通過對相同上清液進行多重細胞因子測定分析附加的16種細胞因子,其中ifn
?
γ顯示在a中。結果代表兩個獨立實驗。
108.圖11.mr1t細胞克隆顯示多種趨化因子受體表達譜。通過七個選定的靜息mr1t細胞克隆對cxcr3、ccr4和ccr6表面表達進行流式細胞術分析。圖表示出了通過將特定mab染色的中值熒光強度(mfi)除以相應同型對照的mfi而計算的相對熒光強度。數據代表兩個獨立實驗。
109.圖12.mr1t細胞減少小鼠中人黑素瘤肺結節的數量。向免疫失能的nsg小鼠注射表達mr1(a375
?
mr1)和mr1t細胞的人黑素瘤a375細胞。在第14天,處死小鼠并在印度墨水灌注后計數肺結節。
110.p<0.0001(非配對student t檢驗)。
111.示例
112.方法
113.細胞。以下人細胞系獲自美國典型培養物保藏中心:a375(黑色素瘤)、thp
?
1(髓單核細胞白血病)、j.rt3
?
t3.5(tcrβ缺陷型t細胞白血病)、ls174t(結腸腺癌)、hct116(結腸
癌)、huh7(肝細胞癌)、hek 293(人胚腎)和ccrf
?
sb(急性b細胞淋巴母細胞白血病)。skw
?
3細胞(tcrα、β、γ和δ基因缺陷的人t細胞白血病)獲自萊布尼茨研究所dsmz
?
德國微生物和細胞培養物保藏中心。兩個代表性的mait克隆(mrc25和smc3)和一個tcrγδ克隆(g2b9)((gober et al.,the journal of experimental medicine 197,163
?
168(2003))在該研究中用作對照細胞,從兩個健康供體的血液中產生,并如前所述保持在培養物中(lepore et al.,nat commun 5,3866(2014))。mr1t細胞從健康個體的外周血中分離出來,在采集血液時獲得獻血者的知情同意,并獲得“北西倫理委員會和zentraschweiz/eknz(139/13)”的批準。簡而言之,通過陰性選定純化的t細胞(easysep
tm
人t細胞富集試劑盒,stemcell)每周用輻射(80灰度)a375
?
mr1細胞(比例2:1)刺激一次,持續三周。人ril
?
2(5u/ml;hoffmann
?
la roche),ril
?
7和ril
?
15(均為5ng/ml,peprotech)在每次刺激后第+2和+5天加入。最后一次刺激后12天,洗滌細胞并與a375
?
mr1細胞共培養過夜(比例2:1)。然后cd3+cd69+cd37+細胞在pha(1μg/ml,wellcome research laboratories)、人ril
?
2(100u/ml,hoffmann
?
la roche)和輻射pbmc(5x105細胞/ml)存在下通過限制稀釋進行分選和克隆。在其他實驗中,使用與分選的cd3
+
cd69
+
cd137
+
相同的方案,在用a375
?
mr1細胞(比例2:1)進行單次過夜刺激時,產生mr1t細胞克隆。按照相同的方案周期性地再刺激t細胞克隆(lepore等人,同上)。根據制造商的說明書,使用easysep人cd14和cd19陽性選定試劑盒(stemcell technologies)從健康供體的pbmc純化單核細胞和b細胞(>90%純度)。如前所述(lepore等人,同上),通過在gm
?
csf和il
?
4存在下培養,使mo
?
dc與純化的cd14
+
單核細胞分化。根據公開的方案(graves等人,journal of immunological methods 414,20
?
31(2014))從無腫瘤個體的腸活組織檢查分離人正常腸上皮細胞(gec)。
114.表達與β2m共價聯接的mr1a基因的細胞的產生。如前所述(lepore et al.,同上),通過pcr產生經由柔性gly
?
ser接頭與β2m聯接的人mr1a cdna構建體。使用以下引物將mr1a cdna中的k43a取代引入融合構建體:mr1k43a_f5'
?
ctcggcaggccgagccacgggc(seq id no 097)和mr1k43a_r 5'gcccgtggctcggcctgccgag(seq id no 098)。將得到的wt和突變體構建體克隆到雙向慢病毒載體(lv)中(lepore等人,同上)。根據制造商的說明書,使用metafectene pro(biontex),用單獨的lv
?
mr1a
?
β2m構建體與慢病毒包裝質粒pmd2.g、pmdlg/prre和prsv
?
rev(addgene)一起轉染hek 293細胞。在8μg/ml硫酸魚精蛋白存在下,通過含有病毒顆粒的上清液的自旋感染轉導a375和thp
?
1細胞。通過流式細胞術評估mr1的表面表達,并對陽性細胞進行facs分選。
115.可溶性重組β2m
?
mr1
?
fc融合蛋白。使用上述人mr1a
?
β2m構建體作為模板獲得β2m
?
mr1
?
fc融合構建體。使用引物:β2mxhoi_f5'
?
ctcgagatgtctcgctccgtggcctta(seq id no 099)和mr1
?
igg1_r5'
?
gtgtgagttttgtcgctagcctgggggacctg(seq id no 100),通過pcr擴增與β2m
?
mr1a基因互補的dna,從而排除mr1跨膜和細胞內結構域。使用以下引物產生與人igg1重鏈的鉸鏈區和ch2
?
ch3結構域互補的dna:nhei
?
hinge
?
f5'
?
caggtcccccaggctagcgacaaaactcacac(seq id no 101)和igg1noti_r5'
?
gcggccgctcatttacccggagacagggaga(seq id no 102)pfuse
?
higg1
?
fc1(invivogen)。使用具有重疊延伸pcr的兩步剪接將β2m
?
mr1a和igg1 pcr產物連接在一起,并將得到的構建體亞克隆到bcmgsneo表達載體的xhoi/noti位點中。使用metafectene pro(biontex)用最終構建體轉染cho
?
k1細胞,通過有限稀釋克隆并通過elisa篩選以產生β2m
?
mr1
?
fc融合蛋白。適用于ex
?
cell acf cho無血清培養基
res 3,236
?
244(2015))。將新切除的腫瘤在鹽水中充分洗滌、稱重,并使用dounce組織研磨機將4g質量在7ml hplc級水中勻漿。腫瘤勻漿經歷兩次凍
?
融循環,在4℃下離心(3,250g)10分鐘,收集上清液并儲存在
?
70℃。用2ml hplc級水第二次提取沉淀,在4℃下離心(5,100g)10分鐘,收集上清液并儲存在
?
70℃下。在室溫下通過渦旋將該沉淀物用9ml hplc級甲醇進一步提取5分鐘,在4℃下離心(5,100g)10分鐘,并收集上清液。合并三個上清液,干燥并重新混懸于水:甲醇(10:1)中。如上所述使用c18和nh
2 sep
?
pak柱分離物質。
121.t細胞活化測定。mr1限制性t細胞(5
×
104/孔,除非另有指明)與指定的靶細胞(5
×
104/孔)在200μl總體積中一式兩份或一式三份進行共培養。將t細胞與指定的apc一起培養24小時。在一些實驗中,加入抗mr1 mab(克隆26.5)或小鼠igg2a同型對照mab(均為30μg/ml)并在加入t細胞之前孵化30分鐘。從在lb培養基中生長的dh5α菌株(invitrogen)制備大腸桿菌裂解物,并在指數級生長期間收集。將細菌細胞在pbs中洗滌兩次,然后通過超聲處理裂解。離心(15,000g持續15分鐘)后,收集上清液、干燥,并在
?
70℃下儲存。在加入t細胞之前,用相當于108cfu/ml(除非另有說明)的大腸桿菌裂解物將apc脈沖4小時。在一些實驗中,在與t細胞共培養之前,將apc與6
?
fp或ac
?6?
fp(schircks laboratories))預孵育4小時。在用表達tcrvγ9和vδ2鏈的tcrγδ細胞的對照實驗中,在加入t細胞之前,首先用唑來膦酸鹽(10μg/ml)處理apc 6小時。通過將β2m
?
mr1
?
fc包被在96孔板(4μg/ml)上并在37℃下用柱純化的細胞裂解物加載4小時,用板結合的重組人β2m
?
mr1
?
fc進行活化實驗,然后洗滌兩次并添加t細胞。24小時后收集上清液,并通過elisa評估ifn
?
γ或gm
?
csf。根據制造商的說明書,細胞培養上清液中的多種細胞因子和趨化因子使用milliplex map人細胞因子/趨化因子磁珠板
?
預混合41plex(hcytmag
?
60k
?
px41;merck millipore)。在flexmap 3d系統(merck millipore)上獲得樣品,并使用milliplex分析軟件確定平均熒光強度和分析物濃度。
122.殺傷腫瘤細胞。在存在或不存在抗mr1 mab(30μg/ml,克隆26.5)的情況下,使用靶細胞系(2
×
104細胞/ml)進行殺傷測定,該靶細胞系單獨或與不同e/t比例的t細胞孵育24小時。如前所述,靶細胞用pe
?
膜聯蛋白v(bd)和碘化丙啶(pi)(sigma
?
aldrich)染色(2)。通過用抗cd3 mab染色鑒別t細胞并從分析中排除。細胞凋亡評估如下:膜聯蛋白v
+
pi
+
=晚期凋亡和膜聯蛋白v
?
pi
+
=壞死。還示出了在不存在t細胞的情況下(自發凋亡;沒有t細胞)凋亡+壞死細胞的百分比。
123.統計值。使用非配對student t檢驗(prism 6,graphpad軟件)分析數據。
124.鑒別和表征健康供體中新型腫瘤反應性mr1限制性t細胞
125.發明人檢測了在人mait細胞庫的早期研究期間不與微生物配體反應的非典型mr1限制性t細胞克隆。該t細胞克隆(dgb129)識別組成型顯示表面mr1的細胞系(ccrf
?
sb淋巴細胞白血病細胞,或thp
?
1單核細胞白血病細胞;圖1a)或用mr1基因轉染(a375黑素瘤細胞;a375
?
mr1;圖1a),在沒有任何外源添加的抗原的情況下(圖1b)。mr1+靶細胞的無菌識別通過用抗mr1單克隆抗體(mab)阻斷而受到完全抑制(圖1b),因此類似于平行評估的mait細胞對大腸桿菌衍生抗原的反應(圖1c)。重要的是,dgb129t細胞也未能識別合成的mait細胞激動劑6,7
?
二甲基
?8?
d
?
核糖基嗪(rl
?
6,7
?
dime;圖1d)與對照mait細胞克隆不同,該克隆通過該化合物以mr1依賴性方式刺激(圖1e)。dgb129細胞不表達典型的mait細胞的經典型半不變tcr(表1)。
126.發明人研究了dgb129克隆是否代表不同于微生物反應性mait細胞的新型腫瘤反應性mr1限制性t細胞群。因此,他們建立了一種分離和研究這些不可預測的mr1限制性t細胞的方法。來自兩個健康供體的純化t細胞用增殖標記物celltrace紫色(ctv)標記,并在不存在外源抗原的情況下用經照射的a375
?
mr1細胞刺激。用a375
?
mr1細胞再次攻擊增殖細胞,并通過有限稀釋分選和克隆表達高水平活化標記cd137的那些細胞(圖2a)。然后研究各個t細胞克隆識別缺少mr1的a375
?
mr1和a375細胞(a375
?
wt)的能力。在兩個供體中,發明人發現大部分的t細胞克隆(分別為126/195和37/57)顯示a375
?
mr1細胞的特異性識別(圖2b、圖d),其被抗mr1阻斷mab抑制(圖2c、圖e)。用12個mr1反應性t細胞克隆的tcr vβ特異性mab染色顯示它們表達7種不同的trbv鏈(trbv4
?
3、6
?
5/6
?
6/6
?
9、9、18、25
?
1、28、29
?
1)其中一些克隆共享相同的trbv基因。此外,沒有一個表達trav1
?
2鏈,對mait細胞來說是經典的。
127.缺乏特異性標記物使得難以通過標準流式細胞術在體外單獨鑒別這些新型t細胞。因此,通過在非常短時間的體外刺激和單個t細胞克隆實驗之后組合流式細胞術分析來估計其頻率。將來自五個健康供體的純化的血液t細胞與mr1缺陷的或mr1足夠的a375細胞共培養過夜,并分析活化標記物cd69和cd137的表達(圖3a)。在篩選的所有五個供體中,用a375
?
mr1細胞(范圍為t細胞的0.034
?
0.072%)刺激后檢測到的cd69
+
cd137
+
t細胞百分比始終高于與a375
?
wt細胞共培養后的百分比(范圍為0.015
?
0.032%)(圖3a、圖b)。由于兩種類型的apc對mr1表達不同,mr1反應性t細胞在用mr1陽性apc刺激后導致活化的t細胞數量增加。使用該方法,發明人估計所分析的個體的循環t細胞庫含有a375
?
mr1反應性t細胞,頻率范圍在1:2500(0.072
?
0.032=0.04%)和1:5000(0.034
?
0.015=0.019)之間。該估計頻率高于抗原暴露后肽特異性cd4
+
t細胞的頻率(lucas et al.,j virol 78:7284
?
7287;su et al.,immunity 38:373
?
383)。這些觀察結果得到平行實驗的支持,其中克隆了來自這些供體之一(供體c,圖3a,右圖)的分選的cd69
+
cd137
+
過夜活化的t細胞。實際上,96個篩選的t細胞克隆中的31個(32%)顯示出對a375
?
mr1細胞的特異性反應性(圖3c),其被抗mr1 mab抑制(圖3d)。因此,該供體的血液t細胞中計算出的a375
?
mr1反應性t細胞的頻率為1:5000(0.065
×
0.32=0.02%),該值與估計范圍一致。對來自三個供體的代表性t細胞克隆的詳細分析證實其顯示出不同的tcrα和β鏈,并且表明cd4、cd8和cd161的差異表達(表1)。
128.總的來說,這些發現表明,所鑒別的腫瘤反應性mr1限制性t細胞是健康人個體(下文稱為mr1t細胞)血液中新的但常見的淋巴細胞多克隆群。
129.mr1t細胞tcr基因轉移賦予mr1限制的腫瘤細胞識別
130.發明人接下來研究了mr1t細胞對腫瘤細胞的反應性是否由tcr介導。在tcr缺陷的skw
?
3細胞中克隆來自不同mr1t細胞克隆的成對tcrα和β基因并使其表達,賦予對腫瘤細胞的mr1的識別能力,其與原始mr1t細胞顯示的mr1識別類似,并且被抗mr1
?
mab完全阻斷(圖4a
?
圖c)。在對照實驗中,代表性mait細胞克隆的tcrα和β基因的轉移賦予了僅在存在大腸桿菌抗原的情況下以mr1依賴性方式識別a375
?
mr1細胞的能力(圖4d)。這些數據突出了tcr在介導腫瘤細胞的mr1t細胞識別中的關鍵作用,并且表明mr1t細胞tcr基因轉移可以有效地將選定的t細胞的反應性重定向至表達mr1的腫瘤細胞。
131.mr1t細胞克隆對腫瘤細胞的鑒別識別
132.已經產生了大量的mr1t細胞克隆與表達mr1的a375黑素瘤細胞反應,發明人接下來研究了其是否也能識別組成型表達表面mr1的其他類型的腫瘤細胞,包括thp
?
1髓單核細
胞、huh7肝細胞瘤細胞、hct116結腸癌細胞和ls 174t杯狀結腸腺癌細胞。所有這些細胞類型在微生物抗原存在下以mr1依賴性方式支持mait細胞活化(圖5a)。相同的細胞能夠在不同程度上誘導選定的mr1t細胞克隆的無菌活化。大多數測試的mr1t細胞克隆識別thp
?
1細胞,隨后是huh7肝細胞瘤細胞、ls174t杯狀細胞和hct116結腸癌細胞(圖5b)。重要的是,所有反應都被抗mr1 mab阻斷。
133.這些數據進一步證實mr1t細胞是限于非多態性抗原呈遞分子mr1的腫瘤反應性t細胞的新型的和多樣性的細胞。
134.mr1t細胞識別腫瘤細胞中存在的mr1結合抗原
135.發明人接下來研究了mr1t細胞對腫瘤細胞的反應性的基礎。首先,他們尋求明確排除mr1t細胞克隆能夠識別微生物抗原的可能性,類似于mait細胞。而對照mait細胞克隆僅在大腸桿菌裂解物存在下與a375
?
mr1細胞反應,不同的mr1t細胞克隆的活化沒有被大腸桿菌裂解物增強(圖6a)。與這些數據一致,mr1陰性的a375
?
wt細胞未能刺激任何類型的t細胞,無論大腸桿菌裂解物是否加入(圖6a),重要的是抗
?
mr1 mab有效阻斷mr1t和mait細胞兩者反應(圖6a)。這些發現證實了存在于大腸桿菌中并刺激mait細胞的微生物配體不會刺激測試的mr1t細胞。
136.然后,發明人測試了mr1t細胞對已知的mr1配體6
?
fp和ac
?6?
fp的反應,其先前已報道刺激trav1
?
2陰性t細胞的稀有亞組并抑制微生物抗原的mait細胞活化。在存在6
?
fp或ac
?6?
fp配體的情況下mr1t細胞刺激受損,其也損害了大腸桿菌對對照mait細胞的刺激,但不破壞由相同apc呈遞的對同源抗原的對照tcrγδ細胞反應,因此排除了化合物毒性(圖6b、圖c和圖7a至圖c)。值得注意的是,當轉錄靶a375細胞以表達具有缺陷配體結合能力的突變mr1分子時,6
?
fp或ac
?6?
fp未能抑制mr1t細胞或mait細胞的活化(通過賴氨酸43突變為丙氨酸,a375
?
mr1 k34a,用配體阻斷席夫堿的形成;圖6b、圖c和圖7d、圖e)。用6
?
fp或ac
?6?
fp觀察到的特異性抑制表明mr1t細胞i)不識別6
?
fp和ac
?6?
fp;ii)與mr1結合的細胞抗原反應;和iii)受不需要與mr1形成希夫堿的配體刺激。
137.為了獲得關于識別的抗原的起源的進一步信息,發明人研究腫瘤靶細胞的刺激能力是否依賴于培養基成分,因為一些mr1配體,例如6
?
fp可能源自用于細胞培養的rpmi 1640培養基中存在的葉酸。將thp
?
1和a375
?
mr1細胞徹底洗滌并在僅補充有5%人血清的磷酸鹽緩沖鹽水溶液(pbs)中培養4天。每天洗滌細胞,然后用于刺激dgb129 mr1t細胞,并在pbs中進行t細胞活化測定。在rpmi 1640或pbs中生長的thp
?
1和a375
?
mr1細胞顯示相同的刺激能力(圖8a、圖b),因此表明培養基成分不使mr1t細胞活化。為了直接研究刺激性抗原是否存在于靶腫瘤細胞中,本發明人然后使用兩種類型的腫瘤裂解物作為抗原來源進行t細胞活化測定。第一裂解物從體外培養的thp
?
1細胞獲得,而第二裂解物是在切除后立即從小鼠乳腺腫瘤制備的。獲得兩種疏水性和四種親水性分離物,并使用組成型表達低水平mr1的thp
?
1細胞作為apc進行測試。dgb129克隆僅與n4分離物反應,其含有從新鮮移植的小鼠腫瘤和體外培養的thp
?
1細胞兩者分離的高度親水性化合物(圖8c、圖d)。這些結果排除了刺激性抗原來源于rpmi 1640成分的可能性并表明了其細胞來源。發明人還用另一種代表性mr1t細胞克隆dgb70測試了thp
?
1裂解物產生的分離物。dgb70細胞識別分離物n3而不識別分離物n4(圖8e),表明至少兩種不同的復合物不同地刺激兩種mr1t克隆。將相同的分離物加載到塑料結合的mr1分子上并顯示出替代和特異性刺激能力,即n3僅刺激dgb70細胞,
而n4僅刺激dgb129細胞(圖8f)。在不存在n3和n4分離物的情況下,兩個克隆不與mr1反應,進一步表明需要特異性抗原。
138.總之,這些數據表明mr1t細胞識別與不是源自培養基的配體復合的mr1,并且也存在于體內生長的腫瘤細胞中。
139.mr1t細胞顯示出不同的抗腫瘤反應
140.為了評估mr1t細胞的抗腫瘤活性,本發明人測試了其在體外直接殺傷腫瘤細胞的能力。兩種代表性的mr1t細胞克隆(dgb129和dgb70)以各種效應子:靶比例有效殺傷表達mr1的thp
?
1和a375細胞兩者(圖9a、圖b)。對照mait細胞克隆未能殺傷這兩種細胞類型,盡管當靶向被大腸桿菌感染時其完全能夠殺傷(未示出)。這些結果表明mr1t細胞顯示出對表達mr1的腫瘤細胞的特異性細胞毒活性。
141.已經發現mr1 t細胞識別并殺傷了髓單核細胞腫瘤細胞系thp
?
1,發明人接下來解決了其是否也能識別正常骨髓細胞,這包括來自不同供體的單核細胞和單核細胞衍生的樹突細胞(mo
?
dc)。任何測試的mr1t細胞克隆都未識別單核細胞(未示出)。相反,一些mr1t細胞克隆以mr1依賴性方式與mo
?
dc反應(圖9c)。有趣的是,用代表性dgb129 mr1t細胞克隆進行的實驗表明,mo
?
dc的識別不會導致mo
?
dc殺傷(未示出),而是通過mo
?
dc促進cd83和cd86活化標記物的上調(圖9d)。值得注意的是,抗
?
mr1 mab完全抑制了dgb129細胞誘導的mo
?
dc的活化(圖9d)。這些數據表明,一些腫瘤反應性mr1t細胞引發直接的抗腫瘤活性并且還促進先天免疫細胞的活化,這對建立有效的抗腫瘤免疫應答具有重要意義。
142.當發明人觀察到一些mr1t細胞克隆與hct116和ls174t腸腫瘤細胞反應時,他們接下來研究其是否也能識別從腸道活組織檢查制備的正常腸上皮細胞(gec)。gec細胞對任何測試的hct116或ls174t反應性mr1t細胞克隆都沒有刺激作用(圖9f、圖g),因此表明mr1t細胞克隆可能顯示胃腸道腫瘤細胞的特異性識別而不對正常腸上皮細胞產生反應。
143.為了進一步評估mr1t細胞識別腫瘤的特異性,發明人最終研究了它們是否能與其他類型的正常細胞反應,包括嗜中性粒細胞、nk細胞、b細胞和t細胞。這些細胞中沒有一種被測試的mr1t細胞識別(未示出)。
144.總的來說,這些數據將mr1t細胞鑒別為人mr1限制性t淋巴細胞的新型和多樣性細胞,其i)對各種類型的腫瘤細胞不同反應;ii)顯示對腫瘤細胞的細胞毒活性;iii)不識別正常細胞體外
?
分化的mo
?
dc和iv)不會殺傷mo
?
dc而是誘導其活性。這些發現表明mr1t細胞顯示出重要的抗腫瘤特性,并且值得開發用于其免疫治療潛力。
145.mr1t細胞在功能上是多樣性的
146.發明人最終分析了a375
?
mr1腫瘤細胞刺激后代表性mr1t細胞克隆的細胞因子分泌譜。測試的所有克隆釋放ifn
?
γ(圖10a)。然而,發明人還觀察到th1(il
?
2、tnf
?
α和tnf
?
β)、th2(il
?
3、il
?
4、il
?
5、il
?
6、il
?
10、il
?
13)和th17細胞因子(il
?
17a、g
?
csf、gm
?
csf)和其他可溶性因子(mip
?
1β、可溶性cd40l pdgf
?
aa和vegf的不同表達譜;圖10b)。由mr1t細胞表達的細胞因子的可變組合和數量表明該細胞具有相當大的功能可塑性。例如,克隆dga4分泌大量il
?
17a、il
?
6、tnf
?
α和gm
?
csf,但未能分泌原型th2細胞因子il
?
4、il
?
5、il
?
10或il
?
13,因此顯示出'非典型'th17樣表型。相反,克隆tc5a87釋放了大量的vegf和pgdf
?
aa,但只有少量的th1或th2細胞因子,而沒有il
?
17a。值得注意的是,研究的7個克隆中的4個(dgb129、ch9a3、dgb70、jma)顯示出細胞因子釋放的th2
?
偏斜特征,這是最近與保護性抗腫
瘤免疫相關的功能表型。
147.發明人接下來研究了已知由具有不同功能的t細胞亞組差異表達的三種選定趨化因子受體的表達,并且其替代組合表達調節t細胞再循環和向不同歸巢位點的遷移。除dga4外,所有mr1t細胞克隆顯示高水平的cxcr3(圖11)。此外,本發明人觀察到ccr4和ccr6的不同表達模式(圖11),這進一步表明mr1t細胞是多樣性的。
148.在最后一系列研究中,研究了mr1t細胞是否使用肺實體腫瘤模型在體內維持其腫瘤殺傷能力。靜脈內注射表達mr1的a375黑素瘤細胞的小鼠接受dgb129細胞或不處理。在第14天,處死小鼠并計算肺中腫瘤結節的數目。雖然未處理的小鼠顯示200至250個結節,但用mr1t細胞處理的小鼠顯示1
?
6個結節(圖12)。這些結果證實,體內生長的腫瘤細胞產生刺激mr1t細胞的抗原。重要的是,它們提供了mr1t細胞體內殺傷實體瘤細胞的有效能力的有力證據。
149.總之,這些數據表明,此處測試的腫瘤mr1反應性t克隆在表型上和功能上是多樣的,因此表明mr1t細胞包括具有不同再循環模式和組織歸巢能力的多個亞組,并且可能在腫瘤免疫中具有不同的作用。最后,這些數據將mr1t細胞鑒別為識別mr1:腫瘤相關抗原復合物并可參與具有多種效應功能的抗腫瘤免疫應答的人t淋巴細胞的新群體。
150.表格1.選定mr1反應性t細胞克隆的表型。
[0151][0152]
表格2.由人mr1t細胞識別的腫瘤細胞系。
[0153][0154]
以下示例進一步說明了應用本發明的臨床工作流程:
[0155]
篩選表達mr1的癌癥
[0156]
使用對人mr1特異的mab和mr1 mrna的pcr擴增分析癌癥患者的組織新鮮或新鮮冷凍組織活檢組織的mr1表達。
[0157]
癌癥治療,示例1:選定用于識別表達原代mr1的癌細胞的最佳mrt1 tcr基因。
[0158]
i.分離體外的原代mr1
+
癌細胞用于刺激先前表征的mr1t細胞克隆的庫。每個克隆表達不同的tcr基因并識別不同類型的癌細胞。
[0159]
ii.選定對患者的癌細胞最佳反應的mr1t細胞克隆,并將其tcr基因用于tcr基因療法。根據細胞因子釋放和/或表面標記物表達測定反應。通過內部(細胞因子)或表面標記染色用對測定的活化標記物具有反應性的抗體測定細胞,例如但不限于cd3、cd69、cd137、cd150和/或icos(表面標記物)和inf
?
γ以及gm
?
csf(細胞因子)。
[0160]
iii.當可用的可溶性mr1t tcr將被多聚化并用于染色從腫瘤活組織檢查分離的腫瘤細胞。與腫瘤細胞結合的mr1t tcr多聚體將允許快速選定適合該患者的基因療法的mr1t tcr。
[0161]
iv.幾種循環的患者t細胞群可用作受體t細胞(原初細胞、中樞記憶、效應記憶、cd4
+
、cd8
+
或cd4,cd8雙陰性t細胞)。選定原初細胞,當其被識別mr1
?
腫瘤抗原的tcr基因轉導時,允許未標記的t淋巴細胞在腫瘤細胞存在下成熟。使用中樞和效應記憶細胞是因為它們在識別表達mr1的腫瘤細胞時提供即時增殖和效應功能(腫瘤殺傷)。選定cd4細胞以提供足夠數量的t輔助細胞,其促進具有抗腫瘤功能的其他細胞的增長和擴增。選定cd8 t細胞以促進腫瘤細胞的殺傷。選定cd4至cd8雙陰性t細胞用于其先天樣功能,諸如立即釋放大量殺傷效應分子(tnfα、顆粒酶和顆粒溶素)。
[0162]
v.表達轉導的tcr基因和具有選定的效應子功能的t細胞用于過繼細胞療法(act)。
[0163]
來自患者外周血的t細胞用對表面標記物(cd4、cd8、cd27、cd45ra、cd57)特異的單克隆抗體染色并分選。用human t
?
activator cd3/cd28(thermofisher)激活每個分選的群體,并在24小時后用編碼為個體患者選定的mr1t tcr的tcr基因轉染。這產生了修飾的t細胞制劑(受體t細胞)。在一些情況下,受體t細胞也通過基因編輯方法修飾以失活pd1、ilt2和ilt4抑制基因或用cd137和cd134基因轉導以促進細胞存活、細胞擴增和增強抗癌效應子功能。
[0164]
受體的癌癥患者使用非清髓性化療制備方案(60mg/kg環磷酰胺施用2天;2525mg/m2氟達拉濱施用5天)進行淋巴細胞清除,隨后將t細胞和il
?
2轉移至耐受性720,000iu/kg。在某些情況下,200或1200厘戈瑞(cgy;1gy=100拉德)將全身照射加入制備方案中。將表達mr1t外源tcr基因(修飾的t細胞制劑)的t細胞轉移到受體中。
[0165]
將tcr基因克隆到安全的重組慢病毒載體中(參見例如provasi等人,nat med 18,807
?
815(2012)),其含有自殺基因并且在不存在其他輔助病毒的情況下不能產生成熟的病毒顆粒。在一些情況下,將tcr基因克隆到含有自殺基因的載體中(例如,參見greco等人,front pharmacol 6,95(2015)),從而降低了由不需要的基因插入引起的風險。在一些情況下,編碼tcr mr1t基因的rna在受體細胞中轉染(參見例如zhao等人。分子療法13,151,2006))。
[0166]
癌癥療法,示例2:從待治療患者的腫瘤浸潤淋巴細胞(til)中分離mr1t細胞。
[0167]
vi.根據我們先前建立的方案(de libero,同上),從癌組織活組織檢查制備自體
til。
[0168]
vii.使用補充有il
?
2、il
?
7和il
?
15的培養基,在體外擴增t細胞2至3周。
[0169]
viii.測試擴增的t細胞對自體mr1
+
癌細胞的反應性。增加活化標記物(cd137、cd150、cd69、icos)表面表達的t細胞被認為是癌癥特異性的,如果它們被抗mr1單克隆抗體的存在所抑制,則它們被認為是mr1依賴性的。
[0170]
如上所述,癌癥反應性t細胞根據上述活化標記物之一的表達進行分選,并擴增以及用于act。
[0171]
序列
[0172]
如果以下說明書頁面中包含的序列與以文本文件形式并行提交的序列方案之間存在差異,則以本說明書中的以下序列為準。
[0173]
全長tcrα和β蛋白序列,包括前導序列。
[0174]
cdr3序列用下劃線顯示
[0175]
seq id 001 tcrα新克隆1
[0176]
mamllgasvlilwlqpdwvnsqqknddqqvkqnspslsvqegrisilncdytnsmfdyflwykkypaegptflisissikdknedgrftvflnksakhlslhivpsqpgdsavyfcaaqiynqggklifgqgtelsvkpniqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
[0177]
seq id 003 tcrα新克隆2
[0178]
mislrvllvilwlqlswvwsqrkeveqdpgpfnvpegatvafnctysnsasqsffwyrqdcrkepkllmsvyssgnedgrftaqlnrasqyisllirdsklsdsatylcvvtgnqfyfgtgtsltvipniqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
[0179]
seq id 005 tcrα新克隆3
[0180]
mltasllraviasicvvssmaqkvtqaqteisvvekedvtldcvyetrdttyylfwykqppsgelvflirrnsfdeqneisgryswnfqkstssfnftitasqvvdsavyfcalseepsntgklifgqgttlqvkpdiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
[0181]
seq id 002 tcrβ新克隆1
[0182]
mgirllcrvafcflavglvdvkvtqssrylvkrtgekvflecvqdmdhenmfwyrqdpglglrliyfsydvkmkekgdipegysvsrekkerfslilesastnqtsmylcassfssgkqyfgpgtrltvtedlknvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgfypdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsesyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdsrg
[0183]
seq id 004 tcrβ新克隆2
[0184]
masllffcgafyllgtgsmdadvtqtprnritktgkrimlecsqtkghdrmywyrqdpglglrliyysfdvkdinkgeisdgysvsrqaqakfslslesaipnqtalyfcatsdvgtgdtgelffgegsrltvledlknvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgfypdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsesyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdsrg
[0185]
seq id 006 tcrβ新克隆3
[0186]
mgirllcrvafcflavglvdvkvtqssrylvkrtgekvflecvqdmdhenmfwyrqdpglglrliyfsydvkmkekgdipegysvsrekkerfslilesastnqtsmylcassrllaggqneqffgpgtrltvledlknvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgfypdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsesyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdsrg
[0187]
全長tcrα和β蛋白序列,包括前導序列。
[0188]
seq id no 013 tcrα克隆4
[0189]
mwgvfllyvsmkmggttgqnidqptemtategaivqinctyqtsgfnglfwyqqhageaptflsynvldgleekgrfssflsrskgysylllkelqmkdsasylcavmdssyklifgsgtrllvrpdiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
[0190]
seq id no 014 tcrα克隆5
[0191]
mllitsmlvlwmqlsqvngqqvmqipqyqhvqegedfttycnssttlsniqwykqrpgghpvfliqlvksgevkkqkrltfqfgeakknsslhitatqttdvgtyfcaaaggtsygkltfgqgtiltvhpniqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
[0192]
seq id no 015 tcrα克隆6
[0193]
mktfagfsflflwlqldcmsrgedveqslflsvregdssvinctytdssstylywykqepgaglqlltyifsnmdmkqdqrltvllnkkdkhlslriadtqtgdsaiyfcaetwtdrgstlgrlyfgrgtqltvwpdiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
[0194]
seq id no 016 tcrα克隆7
[0195]
mamllgasvlilwlqtdwvnsqqknddqqvkqnspslsvqegrisilncdytnsmfdyflwykkypaegptflisissikdknedgrftvflnksakhlslhivpsqpgdsavyfcaaslynqggklifgqgtelsvkpniqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
[0196]
seq id no 017 tcrα克隆8
[0197]
meknplaapllilwfhldcvssilnveqspqslhvqegdstnftcsfpssnfyalhwyrwetakspealfvmtlngdekkkgrisatlntkegysylyikgsqpedsatylcasgdsgyalnfgkgtsllvtphiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
[0198]
seq id no 018 tcrα克隆9
[0199]
mnyspglvslillllgrtrgnsvtqmegpvtlseeafltinctytatgypslfwyvqypgeglqlllkatkaddkgsnkgfeatyrkettsfhlekgsvqvsdsavyfcaltiwdyggsqgnlifgkgtklsvkpniqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
[0200]
seq id no 019 tcrα克隆10
[0201]
mvlkfsvsilwiqlawvstqlleqspqflsiqegenltvycnsssvfsslqwyrqepgegpvllvtvvt
ggevkklkrltfqfgdarkdsslhitaaqpgdtglylcagensgyalnfgkgtsllvtphiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
[0202]
seq id no 020 tcrα克隆11
[0203]
mmkslrvllvilwlqlswvwsqqkeveqdpgplsvpegaivslnctysnsafqyfmwyrqysrkgpellmytyssgnkedgrftaqvdksskyislfirdsqpsdsatylcamslsggsyiptfgrgtslivhpyiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
[0204]
seq id no 021 tcrα克隆12
[0205]
mllehlliilwmqltwvsgqqlnqspqsmfiqegedvsmnctsssifntwlwykqdpgegpvllialykageltsngrltaqfgitrkdsflnisasipsdvgiyfcagqlggaggtsygkltfgqgtiltvhpniqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
[0206]
seq id no 022 tcrα克隆13
[0207]
mtsiravfiflwlqldlvngenveqhpstlsvqegdsavikctysdsasnyfpwykqelgkgpqliidirsnvgekkdqriavtlnktakhfslhitetqpedsavyfcaanwspqgnekltfgtgtrltiipniqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
[0208]
seq id no 023 tcrα克隆14
[0209]
mwgvfllyvsmkmggttgqnidqptemtategaivqinctyqtsgfnglfwyqqhageaptflsynvldgleekgrfssflsrskgysylllkelqmkdsasylcasmdsnyqliwgagtkliikpdiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
[0210]
seq id no 024 tcrα克隆15
[0211]
mislrvllvilwlqlswvwsqrkeveqdpgpfnvpegatvafnctysnsasqsffwyrqdcrkepkllmsvyssgnedgrftaqlnrasqyisllirdsklsdsatylcvvnrftrdgnklvfgagtilrvksyiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
[0212]
seq id no 025 tcrβ克隆4
[0213]
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[0214]
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[0215]
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[0216]
seq id no 027 tcrβ克隆6
[0217]
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[0218]
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[0219]
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[0220]
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[0221]
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[0222]
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[0224]
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[0225]
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[0226]
seq id no 032 tcrβ克隆11
[0227]
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[0228]
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[0229]
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[0230]
seq id no 034 tcrβ克隆13
[0231]
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[0232]
seq id no 035 tcrβ克隆14
[0233]
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[0234]
seq id no 036 tcrβ克隆15
[0235]
mlsllllllglgsvfsavisqkpsrdicqrgtsltiqcqvdsqvtmmfwyrqqpgqsltliatanqgseatyesgfvidkfpisrpnltfstltvsnmspedssiylcsvegrgyeqyfgpgtrltvtedlknvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgfypdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsesyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdsrg
[0236]
全長tcrγ和δ蛋白序列,包括前導序列。
[0237]
seq id no 061 tcrγ克隆1
[0238]
mqwalavllaflspasqkssnlegrtksvirqtgssaeitcdlaegstgyihwylhqegkapqrllyydsytssvvlesgispgkydtygstrknlrmilrnliendsgvyycatwetqelgkkikvfgpgtkliitdkqldadvspkptiflpsiaetklqkagtylcllekffpdvikihwqekksntilgsqegntmktndtymkfswltvpeksldkehrcivrhennkngvdqeiifppiktdvitmdpkdncskdandtlllqltntsayymylllllksvvyfaiitccllrrtafccngeks
[0239]
seq id no 062 tcrδ克隆1
[0240]
mlfssllcvfvafsysgssvaqkvtqaqssvsmpvrkavtlnclyetswwsyyifwykqlpskemiflirqgsdeqnaksgrysvnfkkavksvaltisalqledsakyfcalgvqallpilgdttdklifgkgtrvtveprsqphtkpsvfvmkngtnvaclvkefypkdirinlvsskkitefdpaivispsgkynavklgkyedsnsvtcsvqhdnktvhstdfevktdstdhvkpketentkqpskschkpkaivhtekvnmmsltvlglrmlfaktvavnflltaklffl
[0241]
表x序列id no的指定
[0242]
再多了解一些
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